本文采用RP-HPLC法測(cè)定了臭豆腐和腐乳中的生物胺(色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺)的含量。樣品經(jīng)0.4 mol·L-1液提取, 丹磺酰氯衍生, 流動(dòng)相為乙腈和水，采用梯度洗脫，流速為1mL·min-1，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。結(jié)果表明臭豆腐和腐乳中生物胺的種類及含量因臭豆腐和腐乳的品種而異，臭豆腐中8種生物胺總量平均為6.825 mg·100g-1，腐乳中8種生物胺總量平均為134.383 mg·100g-1。本法用于臭豆腐和腐乳的測(cè)定具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、可靠的優(yōu)點(diǎn)。

Reserch of Biogenic Amines in Stinkytofu and Sufu

Abstract：The biogenic amines content such as tryptamine,phenylethylamine, putrescine, cadaverine , histamine, tyramine, spermidine and spermine in Stinkytofu and Sufu were evaluated simultaneity by RP-HPLC in this paper. Samples were extracted by 0.4mol·L-1 HClO4, and then derived using Dns-Cl. The mobile phase was a gradient elution program with a binary mixture of a cetonitrile and water. The flow rate was 1 mL·min-1. Waters 2487 Dual λ Absorbance detector was used in the final determination with λ =254 nm. It was noticed that the biogenic amine kinds an contents varied with different Stinkytofu and Sufu. The average of total biogenic amine in Stinkytofu was 6.825 mg·100g-1, the average of total biogenic amine in Sufu was 134.383 mg·100g-1.This method of Stinkytofu and Sufu was simple and convenient to work, the result was sensitive to be given rapidly and dependably.

引言 臭豆腐根據(jù)工藝不同分為非發(fā)酵和發(fā)酵兩種。油炸臭豆腐屬于非發(fā)酵臭豆腐,而發(fā)酵的臭豆腐是腐乳的一種,學(xué)名青方腐乳[1] 。臭豆腐種類繁多，主要有長(zhǎng)沙火宮殿臭干子、王致和臭豆腐、湖北臭豆腐、安徽臭豆腐、浙江臭豆腐、江蘇臭豆腐、江西臭豆腐、 貴州臭豆腐、云南臭豆腐等[2] 。腐乳通常分為青方、紅方、白方三大類。其中，臭豆腐屬‘青方’;‘大塊’、‘紅辣’、‘玫瑰’等醬腐乳屬‘紅方’;‘甜辣’、‘桂花’、‘五香’等屬‘白方’。青方是指臭腐乳，又稱青色腐乳，它是在腌制過程中加入了苦漿水、鹽水，故呈豆青色;紅方是腐乳坯加紅曲色素即為紅腐乳;白方是在生產(chǎn)時(shí)不加紅曲色素，使其保持本色。腐乳品種中還有添加糟米的稱為糟方，添加黃酒的稱為醉方，以及添加芝麻、玫瑰、蝦籽、香油等的花色腐乳。臭豆腐和腐乳具有營養(yǎng)價(jià)值高、易消化、室溫保存、食用方便等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者的喜愛。

目前臭豆腐和腐乳的安全衛(wèi)生問題突出。臭豆腐的生產(chǎn)工序是在自然條件下進(jìn)行的，易被微生物污染，造成安全問題。食用自制臭豆腐發(fā)生肉毒桿菌中毒的事亦有報(bào)道 [3] 。據(jù)測(cè)定，平均每1kg臭豆腐含有4.9 g揮發(fā)性鹽基氮、16.5 mg 硫化氫。它們具有一股特殊的臭味和很強(qiáng)的揮發(fā)性，多吃對(duì)健康無益。存放時(shí)間長(zhǎng)了，胺類可能與亞硝酸鹽作用，生成強(qiáng)致癌物亞硝胺。甚至有生產(chǎn)者竟在臭豆腐中加入非食品添加劑——工業(yè)硫酸亞鐵[4] 。工業(yè)硫酸亞鐵被加入后，可與發(fā)酵物作用產(chǎn)生墨黑色的硫化鐵，能使普通香干、豆腐迅速變色上味。一旦食用，會(huì)引起牙齒變黑、腹痛、惡心、嘔吐，嚴(yán)重者還會(huì)導(dǎo)致肺積水、肝變性、休克等癥狀。腐乳的生產(chǎn)采用的是固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，不像現(xiàn)代深層液體發(fā)酵那樣對(duì)發(fā)酵底物進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌，其發(fā)酵過程也是開放式的，因此腐乳作為一種高蛋白食品，其感染病原微生物的機(jī)率相當(dāng)大[5] 。多食或長(zhǎng)期大量食用腐乳，可引起胃腸道疾病或誘發(fā)癌癥。而且服用四環(huán)素類藥物及紅霉素、滅滴靈、甲氰咪胍時(shí)食有腐乳，可使藥效減弱。此外，久食腐乳，可使老年人的組織器官日益衰退，各部分的功能相對(duì)減弱和降低。同時(shí)，可因攝鈉過多誘發(fā)心血管系統(tǒng)及肝、腎等組織器官病變。

作為臭豆腐和腐乳安全性問題之一的生物胺引起了我們實(shí)驗(yàn)組的注意。生物胺(biogenic amines,BA)是指一類含氮的脂肪族、芳香族或雜環(huán)類有機(jī)化合物[6] 。它是一種低分子量的有機(jī)物,主要通過氨基酸的脫羧作用生成。適量的生物胺在人和動(dòng)物的活性細(xì)胞中發(fā)揮著重要的生理作用，如促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)代謝活力、加強(qiáng)腸道免疫系統(tǒng)、并在神經(jīng)系統(tǒng)中有活性、控制血壓，在消除自由基方面也有一定的作用[7,8] 等等。但是當(dāng)生物胺在人體體內(nèi)積累到一定數(shù)量時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生毒害作用，如外部血管膨脹、導(dǎo)致高血壓和頭痛、以及腸道平滑肌的收縮、造成腹部痙攣、嘔吐和腹瀉等[9] ，人們熟悉的亞硝胺就具有極強(qiáng)的致癌作用。組胺和多胺可與H2受體作用或促進(jìn)血管生成而直接導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤。

生物胺分析方法包括比色法、氨基酸分析法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法和色譜法。隨著高效液相色譜及填料的發(fā)展, HPLC在生物胺檢測(cè)方面顯示了其特有的優(yōu)越性。但大多數(shù)生物胺無紫外吸收和熒光發(fā)射特性, 為提高分析檢測(cè)靈敏度和分離選擇性, 通常將生物胺衍生, 衍生方式有柱前衍生法[10]和柱后衍生法[11]。本文采用丹酰氯柱前衍生HPLC法同時(shí)測(cè)定了市場(chǎng)上的8種臭豆腐和10種腐乳中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺的含量，并繪制了這8種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)對(duì)結(jié)果進(jìn)行了比較，希望能夠?yàn)閲鴥?nèi)食品行業(yè)中臭豆腐和腐乳中生物胺的檢測(cè)研究提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

色胺(TRY)、苯乙胺(PHE)、腐胺(PUT)、尸胺(CAD)、組胺(HIS)、酪胺(TYR)、亞精胺(SPD)、精胺(SPM) 、丹酰氯, 均購自Sigma公司;乙腈、丙酮, 均為HPLC級(jí);超純水(南京總馨純水設(shè)備公司生產(chǎn)的型號(hào)為MDL9000(B)-H-30型臺(tái)式實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)制得), 其他試劑均為分析純。

臭豆腐和腐乳：購于南京市場(chǎng)。

生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液: 準(zhǔn)確稱取適量生物胺標(biāo)準(zhǔn)品, 用0.4 mol·L-1高氯酸(HClO4)分別配制成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液, 鋁箔避光、4 ℃保存, 根據(jù)需要用0.4 mol·L-1高氯酸將儲(chǔ)備液稀釋到適當(dāng)?shù)闹虚g濃度。

丹酰氯衍生劑：準(zhǔn)確稱取丹酰氯500 mg至50 mL棕色容量瓶中，用10 mg·mL-1丙酮溶解并定容。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

Waters液相色譜系統(tǒng)(柱溫箱、Empower p ro色譜軟件); Waters Alliance 2695 Separations Module, Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector, AgilentZORBAX XDB-C18 (4.6×250mm2, 5μm)

1.2 方法

1.2.1樣品處理

1.2.1.1標(biāo)準(zhǔn)樣品

準(zhǔn)確稱取色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺各50 mg，用0.4 mol·L-1的高氯酸(HClO4)定容至50 mL，并分別稀釋制成終濃度分別為：0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，加入200μL 2 mol·L-1 NaOH使之呈堿性，再加入300 μL飽和NaHCO3溶液進(jìn)行緩沖，然后再加入2 mL丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(10 mg·mL-1溶于丙酮)，丹磺酰氯溶液在室溫下處于黑暗中反應(yīng)處理。30 min后加入100 μLNH4OH中止反應(yīng)。加入乙腈使終體積為5 mL。衍生處理后0.45 μm濾膜過濾，用于分析檢測(cè)。

檢測(cè)結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2 樣品

分別準(zhǔn)確稱取5 g臭豆腐，剪碎加入20 mL的0.4 mol·L-1的高氯酸(HClO4)，勻漿機(jī)上徹底勻漿，冷凍離心機(jī)4℃、2500 rpm離心10 min，取上清液;沉淀部分如前方法再重新提取。取二次的上清液用0.4 mol·L-1的高氯酸稀釋到50 mL。取1 mL樣液同標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行柱前衍生。

腐乳樣品制法同上。

1.2.2 色譜條件

柱溫：30℃;流速：1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量：20 uL;檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm;流動(dòng)相：水(A溶液)和乙腈acetonitrile(B溶液)，按下面的梯度運(yùn)行。

2 結(jié)果與分析

2.2 臭豆腐和腐乳中生物胺的種類及含量

利用本文建立的方法對(duì)不同種類的臭豆腐和腐乳中的8種生物胺含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

實(shí)驗(yàn)采用乙睛和水為流動(dòng)相，以表1所示的梯度程序洗脫。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品結(jié)果均表明8種組分能有效分離，且峰形對(duì)稱，沒有拖尾等現(xiàn)象(見圖1和圖2)。此外，使用該流動(dòng)相可在前5 min內(nèi)流出全部溶劑峰及其他雜質(zhì)峰，25 min左右試樣中生物胺可被全部洗脫。

由圖1與圖2的對(duì)比分析可見，標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖中，色胺、苯乙胺的吸收峰較低，其余6種生物胺的吸收峰相差不大，且以腐胺的吸收峰為最高。A4樣品生物胺色譜圖中，色胺、苯乙胺和酪胺的吸收峰較標(biāo)準(zhǔn)品都較高，其中酪胺的吸收峰為8種生物胺中最高。

由表2可見，不同公司生產(chǎn)的腐乳生物胺含量有明顯的差異，其中以M公司生產(chǎn)的A3腐乳樣品生物胺總量最少，X公司生產(chǎn)的A8腐乳樣品生物胺含量最高。A3腐乳樣品的生物胺總量?jī)H為13.614 mg·100g-1，A8腐乳樣品的生物胺總量為336.696 mg·100g-1。我們認(rèn)為，這可能與不同公司生產(chǎn)腐乳的生產(chǎn)地區(qū)、原料、加工工藝及貯藏方式等的不同有關(guān)。但是即使是同一家公司生產(chǎn)的腐乳生物胺含量也有明顯的差異，如N公司生產(chǎn)的A5腐乳樣品與A6腐乳樣品比較，A5腐乳樣品的生物胺總量?jī)H為16.603 mg·100g-1，A6腐乳樣品的生物胺總量為326.389 mg·100g-1。這可能與不同腐乳樣品中添加的調(diào)味料的不同有關(guān)。與腐乳相比，臭豆腐中生物胺的含量則明顯少得多，A11臭豆腐樣品中的生物胺含量最高，亦僅有23.897 mg·100g-1。由此可見，臭豆腐和腐乳中生物胺的種類與含量的差別很可能與其加工工藝的不同有關(guān)。因?yàn)楦橹械纳锇泛棵黠@比臭豆腐中的生物胺含量多得多，而生物胺主要通過氨基酸的脫羧作用生成，由此我們可以認(rèn)為，氨基酸的脫羧作用主要發(fā)生在發(fā)酵過程中。

3 討 論

生物胺中腐胺、尸胺、組胺、酪胺因?yàn)榫哂幸欢ǖ亩拘?，是與食品的衛(wèi)生安全最相關(guān)的，故我們主要對(duì)臭豆腐和腐乳中的這四種胺進(jìn)行了分析。腐乳樣品中A6、A8、A9腐乳樣品中的腐胺含量偏高，其中A6腐乳樣品是N公司產(chǎn)品，A8、A9腐乳樣品是X公司產(chǎn)品;腐乳樣品中A2、A6、A9、A10腐乳樣品中的尸胺含量偏高，其中A2腐乳樣品是M公司產(chǎn)品，A6腐乳樣品是N公司產(chǎn)品，A9腐乳樣品是X公司產(chǎn)品，A10腐乳樣品是Y公司產(chǎn)品;腐乳樣品中A2、A6、A8、A9腐乳樣品中的組胺含量偏高，其中A2腐乳樣品是M公司產(chǎn)品，A6腐乳樣品是N公司產(chǎn)品，A8、A9腐乳樣品是X公司產(chǎn)品;腐乳樣品中A4、A6、A8、A9腐乳樣品中的酪胺含量偏高，其中A4腐乳樣品是M公司產(chǎn)品，A6腐乳樣品是N公司產(chǎn)品，A8、A9腐乳樣品是X公司產(chǎn)品。這可能與生產(chǎn)地區(qū)、原料、調(diào)味料、加工工藝及貯藏方式等的不同有關(guān)。臭豆腐樣品中A11、A13樣品中的腐胺含量偏高，A11、A12樣品中的尸胺含量偏高，A11樣品中的酪胺含量偏高。這可能與原料、加工工藝及貯藏方式等的不同有關(guān)。

大量研究表明，組胺是對(duì)人體最有害的一種，而酪胺在量上是最重要的，并且其它生物胺的存在可能加強(qiáng)酪胺對(duì)人類健康的副作用。攝入 8～40mg 組胺產(chǎn)生輕微中毒癥狀，超過 40mg產(chǎn)生中等中毒癥狀，超過 100mg 產(chǎn)生嚴(yán)重中毒癥狀。酪胺超過 l00mg會(huì)引起偏頭痛。所以，通常被看作生物胺中最重要的兩類，并以這兩種生物胺作為測(cè)定指標(biāo)。歐盟、美國都對(duì)部分食品中組胺含量做了限量要求：美國FDA根據(jù)對(duì)爆發(fā)組胺中毒的大量數(shù)據(jù)研究結(jié)果確定組胺的危害作用水平為500 mg·kg-1，同時(shí)要求進(jìn)口水產(chǎn)品組胺不得超過50 mg·kg-1;歐盟規(guī)定鯖科魚類中組胺含量不得超100 mg·kg-1，其他食品中組胺不得超過100 mg·kg-1，酪胺不得超過100～800 mg·kg-1。我國規(guī)定鮐魚中組胺不得超過1000 mg·kg-1，其他海水魚不得超過300 mg·kg-1 [12]。

臭豆腐中組胺平均含量為0.273 mg·100g-1，最大值為0.526 mg·100g-1;腐乳中組胺平均含量為11.801 mg·100g-1，最大值為42.949 mg·100g-1。臭豆腐中酪胺平均含量為0.371 mg·100g-1，最大值為2.211 mg·100g-1;腐乳中酪胺平均含量為45.876 mg·100g-1，最大值為133.121 mg·100g-1。臭豆腐和腐乳中組胺含量均未超標(biāo)，但腐乳中的組胺含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出臭豆腐中的組胺含量。臭豆腐中酪胺含量未超標(biāo)，但是腐乳中酪胺含量則遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出標(biāo)準(zhǔn)。故本次實(shí)驗(yàn)所用的腐乳樣品就酪胺含量而言，一半是不及格，沒有達(dá)到衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的。

不同小吃攤點(diǎn)的臭豆腐生物胺含量相差并不大，而不同的腐乳生物胺含量各異，這說明雖然臭豆腐等非發(fā)酵食品本身含有低濃度的生物胺,但食品中生物胺主要還是由氨基酸經(jīng)乳酸菌脫羧形成,而且高濃度的生物胺往往出現(xiàn)在發(fā)酵食品中,因?yàn)榘l(fā)酵食品更容易污染具有高活性氨基酸脫羧酶的微生物。(周 薇)

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